十博 > 农产电商 >

细胞或培养液中若存在牛病毒性腹泻病毒及其抗体,抗菌药物诱导LPS释放的临床研究

不安全因素及解决方法

核心提示:一、 细胞培养1、制苗用细胞牛睾丸细胞或羊肾细胞。2、生长培养液目前的细胞培养液为乳汉液,或一、 细胞培养1、制苗用细胞牛睾丸细胞或羊肾细胞。2、生长培养液目前的细胞培养液为乳汉液,或MEM+10%新生牛血清+1%双抗,pH7.0~7.2左右。3、维持液目前的维持液为乳汉液,或MEM+2~5%新生牛血清+1%双抗,pH7.4~7.6。4、细胞生长良好的几个注意事项1)制苗用细胞应选用非猪瘟疫区,无口蹄疫、粘膜病等传染病地区的1~4日龄健康小公牛或10日龄以内的健康羔羊。其家H健康生长的2)培养基和血清的质量可靠、稳定。应确保无外源病毒、支原体、细菌等污染,无牛病毒性腹泻病毒及其抗体。用于生产猪瘟细胞苗的牛血清都要事先检测有无BVDV中和抗体的存在。3)制备原代牛睾丸细胞时,防止细胞消化过度。4)合适、营养丰富的细胞培养基。丰富的营养成分对细胞的生长、带毒状态维持和毒价的提高有直接影响。5)转瓶的洗涤应遵循严格的清洗程序。转瓶洗涤不干净,容易导致细胞不贴壁生长。 二、 病毒感染、维持和收获生产用毒种有脾毒和细胞毒,脾毒是用选择定型热反应兔脾脏冷冻或冻干保存制备的;细胞毒是将用新鲜脾毒制成0.3%~0.5%的病毒悬液接种生长良好的牛睾丸细胞或羊肾单层细胞,取二收、三收的细胞培养液作为生产用毒种。脾毒应选择兔体反应在36小时之前,同时防止脾毒采集过程的污染。该病毒不产生细胞病变效应,可连续多次收液。取已形成良好单层的牛睾丸细胞,弃去培养液,接种含3%~5%细胞毒种或0.2%~0.3%脾毒种的维持液。接毒后4或5日第一次收获换液,以后每4-6日收获换液1次,可连续12~15收左右,有的厂家可收更多。一般来说,12~15收前的毒价合格率高,疫苗质量好。接毒时,细胞生长状态的好坏影响细胞产毒。也可对细胞带毒分散,分散比率1:4左右,可增加收次和产量。将检验合格的病毒培养液和5%蔗糖脱脂牛奶稳定剂按一定比例混合,分装,进行冻干。 三、 病毒特征1、猪瘟病毒感染细胞超薄切片的电子显微镜观察表明,该病毒颗粒在膜结合的胞浆内空胞中装配并成熟,然后经胞外释放。2、56℃处理60分钟或60℃10分钟可灭活细胞培养液中的HCV。HCV在pH5~10时稳定,pH5.2时最适宜生长,但在低于pH4或高于pH11时快速灭活。3、猪瘟病毒的抗原性和血清学与牛粘膜/病毒性腹泻病毒密切相关,两者同源性很高,能互相诱导一定程度的同源病毒抗体,细胞或培养液中若存在牛病毒性腹泻病毒及其抗体,可与猪瘟病毒发生中和反应,造成疫苗生产的失败。四、 病毒收获液毒价不高的可能原因如果病毒收获液毒价不高,即病毒家兔感染量较低,制成的疫苗易造成免疫失败。猪瘟疫苗生产中毒价不高的可能原因:1)细胞培养液营养不足,尤其是使用高压灭菌液,高温可使一些营养成分损失,造成细胞生长状态不良;2)细胞培养液较多存在外源病毒,尤其是牛病毒性腹泻病毒会直接造成病毒滴度降低;3)成熟释放的病毒在维持液中耐受性较差,造成病毒滴度较低;4)病毒毒种毒力较低,并在传代过程中弱化。旧规程要求每1 ml病毒原液含病毒≥50,000个家兔感染量方可配苗,现要求提高至每1 ml含病毒≥500,000个家兔感染量。所以,提高疫苗单位毫升病毒量是提高疫苗质量的关键,进行猪瘟疫苗生产工艺的改进或者浓缩疫苗,显得非常必要、急迫。:用不同剂量的C株苗免疫猪,证实免疫剂量与保护水平密切相关。我国猪瘟细胞苗出厂检验以5万倍稀释能致兔体热反应为合格,即每毫升原液含5万RID。规定的免疫剂量为150RID。剂量不足时,攻毒后不能阻止强毒在体内复制和带毒。免疫剂量提高到80~100PD50(约320~400RID),攻毒后能制止亚临床感染,所有耐过猪均不带毒。目前欧洲为消灭HC亚临床感染,多采用加大免疫剂量的方法。欧洲药典规定用C株疫苗免疫时,肌肉注射剂量为100PD50。 五、 猪瘟疫苗生产工艺改进的几点考虑1、使用化学成分明确的细胞培养基化学成分明确的细胞培养基一方面能提供足够的营养,供细胞生长,同时避免动物来源成分带来外源病毒及其抗体的污染。2、使用低血清细胞培养基,减少血清使用量,提高细胞维持时间清大天一有适合细胞培养生长的低血清MEM细胞培养基,可使血清使用量减少50%左右,减少了外源因子污染的几率;并且由于该细胞培养基营养成分较传统细胞培养基丰富,可提高细胞活力水平,增加细胞维持时的营养供给。3、使用改良的转瓶培养细胞使用多层转瓶培养细胞可使单位体积溶液内的细胞数量增加,一方面提高了细胞密度,病毒增殖数量较大;另一方面也对病毒液进行了浓缩,提高了病毒原液的病毒量。4、尽量减少水解乳蛋白的批间差,防止疫苗生产过程的不稳定情况。5、使用质量保证的牛血清血清是牛病毒性腹泻病毒的主要来源,使用质量可靠、无外源病毒的血清可减少此类污染。6、筛选、克隆较高毒力的毒种使用营养成分丰富的细胞培养基筛选较高毒力的毒种,并用之做克隆毒种,制备具较高毒力的毒种。7、使用病毒保护剂有资料显示,在细胞维持液中加入病毒耐热保护剂可减少无效病毒粒子的产生,提高病毒滴度。采用微载体和生物反应器技术生产猪瘟疫苗。阅读全文

一、 细胞培养

不安全因素 外毒素、热源、异体蛋白、内毒素包括革兰氏阴性菌、蛋源、血清和环境。蛋源包括疫苗生产用鸡蛋、SPF鸡蛋(非致病性沙门氏菌、大肠杆菌等污染)、非免疫鸡蛋(鱼粉沙门氏菌污染,定期投入抗生素,减少输卵管炎,蛋壳钙质,畸形蛋)、禽流感疫苗生产用蛋。

1、 制苗用细胞

疫苗污染ET后注射动物的临床反应 肿头,肿脸,停食停水,局部炎症,休克,死亡;生产性能降低;免疫功能下降,易发病,对疫苗应答下降。

牛睾丸细胞或羊肾细胞。

细菌内毒素对细胞培养的影响 改变细胞外形;活化细胞产生信息传递物质,井影响其下游生物;途经反应;抑制维生素活性;影响细胞附着力。

细胞或培养液中若存在牛病毒性腹泻病毒及其抗体,抗菌药物诱导LPS释放的临床研究。2、 生长培养液

LPS的自发释放:内毒素主要成分是脂多糖;抗菌药物诱导细菌释放内毒素;抗菌药物诱导LPS释放的动物实验研究;抗菌药物诱导LPS释放的临床研究。

目前的细胞培养液为乳汉液,或MEM+10%新生牛血清+1%双抗,pH7.0~7.2左右。

应用抗生素导致疫苗中内毒素的释放 庆大霉素、环丙沙星、青霉素、链霉素;兔大肠杆菌性脑膜炎―――静脉注射头孢噻啶、氯霉素、庆大霉素,在24小时内脑脊液中内毒素升高2倍~10倍,在临床上兔的死亡是大量使用抗生素的结果,因为抗生素杀死了大肠杆菌,大肠杆菌裂解,释放出大量的内毒素,从而将兔杀死。

3、 维持液

解决方法

目前的维持液为乳汉液,或MEM+2~5%新生牛血清+1%双抗,pH7.4~7.6。

减少原材料和操作的污染;减少动物源性物质的依赖性;改进生产工艺:应用抗内毒素的药物,如内毒素抗体、内毒素结合蛋白、多黏菌素B和妥布霉素、类脂A结构类似物;抗细胞因子药物如腺苷类药物氯氨酮等,糖皮质激素类如地塞米松等;抗内毒素的中药,如青蒿素、黄连解毒汤,氨基酸如甘氨酸,乳果糖及胆盐。

4、 细胞生长良好的几个注意事项

十博 ,内毒素的消除―――物理方法 超滤、石棉及活性炭吸附、离子交换层析、亲和层析等。

1) 制苗用细胞应选用非猪瘟疫区,无口蹄疫、粘膜病等传染病地区的1~4日龄健康小公牛或10日龄以内的健康羔羊。其家H健康生长的

动物疫苗的质量控制

2) 培养基和血清的质量可靠、稳定。应确保无外源病毒、支原体、细菌等污染,无牛病毒性腹泻病毒及其抗体。用于生产猪瘟细胞苗的牛血清都要事先检测有无BVDV中和抗体的存在。

疫苗生产用毒种、生产用细胞(原代细胞、传代细胞)、疫苗生产工艺、灭活剂、抗生素、血清、佐剂。

3) 制备原代牛睾丸细胞时,防止细胞消化过度。

疫苗生产用毒种 原始种子:我国自行分离和从国外引进。建立3批种子批。主种子批和工作种子批:主种子批是指原始种子批扩增而来;工作种子批是指从主种子批扩增而建立,三级种子均须按《中国兽药典》要求检验。

4) 合适、营养丰富的细胞培养基。丰富的营养成分对细胞的生长、带毒状态维持和毒价的提高有直接影响。

疫苗生产用细胞 原代细胞要求:一般1代~5代内,细胞培养用牛血清、胰蛋白酶、培养基等材料应符合《中国生物制品主要原材料质控标准》要求:疫苗生产的每批细胞均应作外源因子检测,细菌、真菌和支原体检查,均应阴性;传代细胞的要求:细胞库的建立:细胞库体系是指每批产品的起始材料具有一致性;细胞库通常为二级管理,由主细胞库和工作细胞库组成;传代细胞传到一定代次后,致瘤性会增强,须进行致瘤性检查和细胞核型分析;细胞的鉴定:细胞鉴别、外源因子污染、致瘤性、细胞核型或染色体检测、外源病毒。

5) 转瓶的洗涤应遵循严格的清洗程序。转瓶洗涤不干净,容易导致细胞不贴壁生长。

灭活剂 福尔马林:其与病毒蛋白的作用初期仅形成羟甲基化合物,其反应是可逆的,但一旦形成交链后则为不可逆的。福尔马林作用蛋白的结果是病毒发生交联作用或是病毒颗粒凝集。同时,这种作用限制了福尔马林作用于核酸的灭活,因此,在某些情况下尽管病毒抗原已遭到了严重破坏,但仍然会有一些病毒存活。

二、 病毒感染、维持和收获

β-丙内酯优点:直接作用于病毒的DNA或RNA,打断病毒的核酸,使其不能复制遗传物质而起作用,不破坏病毒的外蛋白:β-PL水解成β-羟丙酸;疫苗中无残留,不影响疫苗的稳定性,灭活作用可靠。

生产用毒种有脾毒和细胞毒,脾毒是用选择定型热反应兔脾脏冷冻或冻干保存制备的;细胞毒是将用新鲜脾毒制成0.3%~0.5%的病毒悬液接种生长良好的牛睾丸细胞或羊肾单层细胞,取二收、三收的细胞培养液作为生产用毒种。脾毒应选择兔体反应在36小时之前,同时防止脾毒采集过程的污染。

缺点:β-丙内酯与牛血清白蛋白的结合引起过敏反应。研究发现:接种这种疫苗而导致抗牛白蛋白lgE的产生的原因是由于β-丙内酯与疫苗中的牛白蛋白结合,使这种β-丙内酯―牛白蛋白的结合物变形,从而使疫苗接种动物产生抗牛白蛋白lgE,出现过敏反应。

该病毒不产生细胞病变效应,可连续多次收液。取已形成良好单层的牛睾丸细胞,弃去培养液,接种含3%~5%细胞毒种或0.2%~0.3%脾毒种的维持液。接毒后4或5日第一次收获换液,以后每4-6日收获换液1次,可连续12~15收左右,有的厂家可收更多。一般来说,12~15收前的毒价合格率高,疫苗质量好。接毒时,细胞生长状态的好坏影响细胞产毒。也可对细胞带毒分散,分散比率1:4左右,可增加收次和产量。

抗生素 国外最多应用的是新霉素,国内均用青链霉素,庆大霉素和卡那霉素。临床上新霉素常用于外用,而青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素常用于肌肉和静脉注射;抗生素只能用在细胞制备阶段。国内企业多个生产步骤均添加抗生素,致使疫苗中抗生素含量较高,是导致疫苗不良反应原因之一;疫苗中使用新霉素引起的过敏反应的风险要小于青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素。

将检验合格的病毒培养液和5%蔗糖脱脂牛奶稳定剂按一定比例混合,分装,进行冻干。

动物血清引起的问题 不需要的细胞、细菌、支原体过量生长;补体、免疫球蛋白、生长抑制因子等有害物质成分不明确,影响结果分析;探测、下游处理和纯化;微量遗留蛋白抗原性;中和抗体引起收率降低;突发污染支原体、病毒和朊病毒;诱导分化;不同批号有区别;地域、季节和个体区别;不确定因素多;价格昂贵等。

三、 病毒特征

传代细胞培养注意的几个问题

1、 猪瘟病毒感染细胞超薄切片的电子显微镜观察表明,该病毒颗粒在膜结合的胞浆内空胞中装配并成熟,然后经胞外释放。

前期工作 细胞瓶的新转瓶处理不到位,玻璃中的二氧化硅释放过多,对细胞有损伤;冲洗转瓶的最后一步应用去离子水,而不是注射用水;瓶子刷洗不过关;洗衣粉或洗涤剂残留;细胞瓶塞如用再生橡胶塞对细胞有毒性,建议使用硅胶塞;管道系统中细胞瓶塞上的管道使用所谓“不锈钢”管道对细胞有毒性,建议使用玻璃制成的管道,同时更换硅胶管。

2、 56℃处理60分钟或60℃10分钟可灭活细胞培养液中的HCV。HCV在pH5~10时稳定,pH5.2时最适宜生长,但在低于pH4或高于pH11时快速灭活。

营养液成分 水:注射用水应通过阴阳离子交换柱处理,经电导率仪检测;基础培养基来源:进口产品质量比较稳定可靠,国产产品批次间质量不稳定;基础培养基引起细胞凋亡。血清:过滤、钴60照射除菌。内毒素含量都很高,前者常常灭菌不彻底,后者可解决支原体污染,但照射剂量大易破坏生长因子等影响细胞贴壁。从节约成本角度考虑,建议采用碳酸氢钠即可满足生产要求。

3、 猪瘟病毒的抗原性和血清学与牛粘膜/病毒性腹泻病毒密切相关,两者同源性很高,能互相诱导一定程度的同源病毒抗体,细胞或培养液中若存在牛病毒性腹泻病毒及其抗体,可与猪瘟病毒发生中和反应,造成疫苗生产的失败。

十博 1

四、 病毒收获液毒价不高的可能原因

如果病毒收获液毒价不高,即病毒家兔感染量较低,制成的疫苗易造成免疫失败。猪瘟疫苗生产中毒价不高的可能原因:

1) 细胞培养液营养不足,尤其是使用高压灭菌液,高温可使一些营养成分损失,造成细胞生长状态不良;

2) 细胞培养液较多存在外源病毒,尤其是牛病毒性腹泻病毒会直接造成病毒滴度降低;

3) 成熟释放的病毒在维持液中耐受性较差,造成病毒滴度较低;

4) 病毒毒种毒力较低,并在传代过程中弱化。

旧规程要求每1 ml病毒原液含病毒≥50,000个家兔感染量方可配苗,现要求提高至每1 ml含病毒≥500,000个家兔感染量。所以,提高疫苗单位毫升病毒量是提高疫苗质量的关键,进行猪瘟疫苗生产工艺的改进或者浓缩疫苗,显得非常必要、急迫。

:用不同剂量的C株苗免疫猪,证实免疫剂量与保护水平密切相关。我国猪瘟细胞苗出厂检验以5万倍稀释能致兔体热反应为合格,即每毫升原液含5万RID。规定的免疫剂量为150RID。剂量不足时,攻毒后不能阻止强毒在体内复制和带毒。免疫剂量提高到80~100PD50(约320~400RID),攻毒后能制止亚临床感染,所有耐过猪均不带毒。目前欧洲为消灭HC亚临床感染,多采用加大免疫剂量的方法。欧洲药典规定用C株疫苗免疫时,肌肉注射剂量为100PD50。

五、 猪瘟疫苗生产工艺改进的几点考虑

1、 使用化学成分明确的细胞培养基

化学成分明确的细胞培养基一方面能提供足够的营养,供细胞生长,同时避免动物来源成分带来外源病毒及其抗体的污染。

2、 使用低血清细胞培养基,减少血清使用量,提高细胞维持时间

清大天一有适合细胞培养生长的低血清MEM细胞培养基,可使血清使用量减少50%左右,减少了外源因子污染的几率;并且由于该细胞培养基营养成分较传统细胞培养基丰富,可提高细胞活力水平,增加细胞维持时的营养供给。

3、 使用改良的转瓶培养细胞

使用多层转瓶培养细胞可使单位体积溶液内的细胞数量增加,一方面提高了细胞密度,病毒增殖数量较大;另一方面也对病毒液进行了浓缩,提高了病毒原液的病毒量。

4、 尽量减少水解乳蛋白的批间差,防止疫苗生产过程的不稳定情况。

5、 使用质量保证的牛血清

血清是牛病毒性腹泻病毒的主要来源,使用质量可靠、无外源病毒的血清可减少此类污染。

6、 筛选、克隆较高毒力的毒种

使用营养成分丰富的细胞培养基筛选较高毒力的毒种,并用之做克隆毒种,制备具较高毒力的毒种。

7、 使用病毒保护剂有资料显示,在细胞维持液中加入病毒耐热保护剂可减少无效病毒粒子的产生,提高病毒滴度。

采用微载体和生物反应器技术生产猪瘟疫苗。

十博 2